Introducción
Hasta la aparición del brote de listeriosis por consumo de carne mechada de este verano pasado (2019), los consumidores españoles sólo mostraban preocupación por enfermedades alimentarias microbianas ligadas a Salmonella, E. coli, Clostridium botulinum o Toxoplasma gondii (en el caso de mujeres embarazadas). Sin embargo, Listeria monocytogenes, el agente causal de la listeriosis, es ya una vieja conocida como patógeno de importancia para investigadores y demás personas relacionadas con la seguridad microbiológica de alimentos. L. monocytogenes es un patógeno intracelular facultativo, ampliamente distribuido en el ambiente y que puede causar una invasión severa en el hombre y otros animales homeotermos. Aunque la enfermedad puede afectar a individuos sanos, la mayoría de las veces afecta a neonatos, ancianos, o personas inmunodeprimidas y se manifiesta como septicemia, meningitis o infecciones del Sistema Nervioso Central (SNC). En mujeres embarazadas, las infecciones pueden dar lugar a abortos espontáneos, nacimientos prematuros o muerte fetal.
Según recogen la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA: European Food Safety Authority) y el centro Europeo para el control de Enfermedades (ECDC: European Centre for Disease Prevention and Control), la listeriosis presenta una incidencia baja (respecto a las de otros patógenos alimentarios) que se sitúa entre el 0.4 y 11 casos por cada 100.000 habitantes. Sin embargo, su peligrosidad es muy alta, ya que presenta una gran mortalidad, que alcanza una letalidad global del 24%. Además, en la Unión Europea, no sólo no disminuye la listeriosis sino que desde 2008, se observa una tendencia creciente.
L. monocytogenes cultivada en medio CHROMagar. Las colonias típicas crecen en este medio de cultivo de color azul y diámetro inferior a 3 mm, de contorno regular y halo blanco.
En EE.UU., se calcula que alrededor de 1.600 personas enferman de listeriosis cada año y alrededor de 260 mueren. Según la FDA, los datos epidemiológicos son similares en Europa y repercuten en un coste anual de 206 billones de dólares en EE.UU. lo que sitúa la listeriosis en el tercer puesto de gasto asociado a enfermedades alimentarias por detrás de la salmonelosis y la toxoplasmosis.
Un poco de historia y epidemiología
L. monocytogenes fue descrita por primera vez como agente causal de listeriosis humana en 1929 por A. Nyfeldt a partir de pacientes con septicemia generalizada. Más tarde Schultz y colaboradores aislaron el patógeno de lesiones petequiales en romboencéfalo en pacientes con meningoencefalitis. Aunque esta bacteria se reconociese como patógena, los centros para el registro de brotes de listeriosis no comenzaron hasta 1970. El registro en los años 80, presentó un gran número de brotes de listeriosis en U.S y fue el que desencadenó que L. monocytogenes empezase a ser considerada como un patógeno alimentario de importancia.
En España, el registro de listeriosis fue más lento, y no fue hasta la orden ministerial de 2015 cuando la listeriosis fue incluida entre las enfermedades de vigilancia obligatoria. Antes, los casos eran notificados a través de la Red Nacional de Vigilancia Epidemiológica (RENAVE) de manera voluntaria. Los datos epidemiológicos notificados entre 1997 y 2015 se resumen en un trabajo publicado por Herrador et al. (2019) en el cual se registran 5.696 hospitalizaciones en ese periodo con una tendencia de incremento constante. Un 50% del total se corresponden con individuos mayores de 65 años, con un resultado de 67% de muertes por sepsis o meningoencefalitis. Las mujeres embarazadas representaron el 7% de los ingresos hospitalarios y los neonatos un 4%. Del total de pacientes, el 56.5% estaban inmunodeprimidos. De 2015 a 2018, según el informe de RENAVE, se notificaron 1369 casos confirmados con 124 defunciones lo que supone una letalidad de 9.1%, observándose que el número de casos y la letalidad aumentó con la edad siendo las tasas de incidencia superiores aquellas correspondientes a los niños menores de 1 año y a los adultos mayores de 70 años. Aparte, queda recogido el brote de listeriosis en Andalucía de agosto de 2018 (informe “CCAES informe cierre listeriosis 20190927” del Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social, MSCBS), que se produjo por consumo de carne mechada en una fábrica contaminada con listeria, con 216 afectados. Treinta y siete de los casos fueron mujeres embarazadas. Dos de ellas, sufrieron abortos previos a la semana 20 de gestación. Hubo 3 muertes fetales posteriores a la semana 20 y 6 partos prematuros. Entre los adultos enfermos, 22 personas resultaron con afectación del SNC y 4 con sepsis, de las que 3 fallecieron (mayores de 70 años).
Los resultados de estos registros, demuestran la importancia de la listeriosis como un problema de salud pública a nivel global.
L. monocytogenes: ubicua y adaptable a distintos nichos ecológicos alimentarios
Existen 20 especies descritas dentro del género Listeria de las cuales sólo L. monocytogenes es patógena para el hombre. L. monocytogenes es una bacteria gram+, bacilar y anaerobia facultativa. Esta especie es “robusta”, con unas exigencias físico-químicas muy flexibles, lo que le permite sobrevivir, crecer y potencialmente ser resiliente o colonizar distintos nichos ecológicos tales como suelos, alimentos, superficies de la industria o de nuestras cocinas y proliferar en ellos. Además, es capaz de sobrevivir al paso por el tracto gastrointestinal humano vehiculado en el alimento y llegar al intestino delgado donde puede actuar como patógeno invasivo intracelular.
L. monocytogenes es capaz de sobrevivir y crecer en un rango de pH de 4.7 a 9.2 y en concentraciones de sal de hasta el 10%. Su temperatura de crecimiento óptima está entre 30 y 37o C, pero puede proliferar a temperaturas entre 1 y 43o C. Es capaz de crecer en refrigeración y de sobrevivir durante meses en alimentos congelados. Crece en el ensilado y puede sobrevivir en el suelo durante varios meses. Todo esto, hace que L. monocytogenes sea una bacteria ubicua también en el ambiente alimentario, distribuida en suelos, agua y superficies de fábricas y que pueda soportar procesos tecnológicos en alimentos. El ganado y el ser humano pueden ser portadores asintomáticos y dispersar la bacteria a través de las heces. Su persistencia en el ambiente alimentario se relaciona fundamentalmente con su habilidad para formar biopelículas que les permite colonizar superficies como el acero inoxidable, mármol, granito, vidrio o poliestireno. Estas son un factor clave para su erradicación en la industria alimentaria, debido a que son altamente resistentes a los procesos de limpieza y desinfección. Otro factor de importancia es la presencia de células bacterianas en estado “durmiente” es decir viable pero no cultivable, que en las condiciones adecuadas se activan y pueden desarrollarse y comprometer la seguridad del alimento. Tanto es así, que estudios sostienen que es virtualmente imposible de erradicar en los ambientes de procesado de alimentos.
Antagonismo producido por distintos cultivos de bacterias lácticas depositados sobre un agar sembrado con Listeria monocytogenes. Los cultivos rodeados de un halo de inhibición se corresponden con bacterias productoras de bacteriocinas (péptidos antimicrobianos) con efecto anti listeria.
L. monocytogenes: patógeno intracelular facultativo en el hombre
Un individuo sano presenta un riesgo muy bajo de infección por L. monocytogenes. Se considera que se requiere una dosis elevada de listeria en el alimento para que sea capaz de superar el proceso digestivo y alcanzar el intestino donde tiene lugar la infección. La autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) considera que el 92% de los casos de listeriosis invasivas serían atribuibles a dosis superiores a 100.000 bacterias por porción de alimento contaminado. Sin embargo, la listeriosis es una enfermedad peligrosa por su elevada tasa de muerte.
L. monocytogenes presenta múltiples factores de virulencia importantes para la infección de las células eucariotas, aunque la virulencia no es la misma en todas las cepas. De hecho, existe una variación entre serotipos en la capacidad para causar enfermedad y su potencial epidémico. El serotipado se basa en la identificación de los antígenos somáticos (O) y flagelar (H), que permite la identificación de 13 serotipos. Al menos el 95% de los aislados en alimentos contaminados y casos clínicos son de los serotipos 1/2a, 1/2b, 1/2c y 4b. De ellos, el 4b es el responsable de la mayoría de casos, mientras que 1/2a es el más prevalente en alimentos.
L. monocytogenes cruza la barrera intestinal tras la ingesta del alimento infectado, por tanto se transmite por vía oral. Una vez que listeria alcanza el intestino delgado (ver Figura 2), penetra en la célula eucariota por fagocitosis o endocitosis mediada por receptor con el concurso de internalinas, autolisinas y otras proteínas bacterianas. Se internaliza en vacuolas rodeadas de membrana que en menos de 30 min se lisan, gracias a la secreción de la listeriolisina O y fosfolipasas, lecitinasas y la metaloproteinasas específicas (Mpl), y son liberadas al citosol donde comienzan a replicarse con un tiempo de duplicación de 1 hora. La bacteria poco a poco va recubriéndose de filamentos de actina que más tarde se organizan en una cola con forma de cometa. La polimerización polar de filamentos de actina en el citoplasma propulsa la bacteria hasta contactar con la membrana celular. La longitud de la cola de cometa es mayor cuanto mayor es la velocidad de movimiento de la bacteria. Cuando llega a la membrana plasmática, las células hacen protusiones alargadas hacia el interior de la célula adyacente. El ciclo entero se completa en alrededor de 5 h. Para la replicación hace uso de metabolitos propios y del hospedador y produce nucleomodulinas que inducen cambios en el hospedador orientados a evadir la respuesta inmune.
Estrategias para la eliminación de L. monocytogenes en alimentos
L. monocytogenes es capaz de contaminar una amplia variedad de alimentos y bebidas entre los que se incluyen alimentos crudos y procesados como quesos de pasta blanda de leche cruda, huevos, pescados ahumados refrigerados, patés, carne y vegetales crudos, y alimentos listos para el consumo (RTE) de carne, especialmente carnes y pollo “deli”, ensalada o fruta fresca.
En general, listeria contamina el medio ambiente de las fábricas en aquellos lugares donde encuentra protección frente a las medidas de limpieza y desinfección rutinarias. La contaminación del alimento se produce con frecuencia tras el cocinado y antes del empaquetado. El loncheado de carnes y quesos es un proceso especialmente sensible a la contaminación.
Tecnologías no térmicas aplicadas a Listeria en alimentos
Los tratamientos tradicionales que se llevan a cabo en la industria de pasteurización y esterilización a altas temperaturas pueden garantizar la seguridad de los alimentos. De la misma manera, un proceso de pasteurización, cocinado y limpieza adecuados realizados en el hogar por el consumidor, garantiza la eliminación de listeria. La enfermedad se produce por el consumo de un producto altamente contaminado que no ha sido calentado previamente hasta una temperatura suficiente y homogénea; que se considera de 70o C durante 2 minutos o una letalidad equivalente, lo que se calcula que sería suficiente para reducir en 6 unidades logarítmicas la carga del patógeno de un alimento.
La industria debe ajustar las condiciones de pasteurización o esterilización para cada alimento susceptible de contener listeria ya que las características fisicoquímicas y la composición de la matriz alimentaria influyen en la resistencia del patógeno a los tratamientos térmicos. Actualmente, además, existe una preocupación adicional por la posible contaminación de listeria en los alimentos listos para el consumo (RTE) y los vegetales crudos.
Desde el año 2005 (según la Web Of Knowledge – WOS, FECYT, Ministerio de Ciencia, innovación y universidades), se ha observado un notable incremento del número de publicaciones científicas dedicadas a L. monocytogenes: al conocimiento del patógeno, a las características que determinan su persistencia en los alimentos y su habilidad para invadir y producir enfermedad identificación (alrededor de 250 publicaciones por año); a la identificación (aproximadamente 250 publicaciones por año) y estudios de epidemiología. También se observa un crecimiento en las publicaciones de modelos predictivos de crecimiento de listeria en distintas matrices alimentarias (alrededor de 60 publicaciones por año).
La demanda social actual está orientada hacia alimentos frescos o mínimamente procesados, “saludables” y con largos periodos de caducidad para su consumo. Entre estos alimentos son los RTE los que suponen una mayor preocupación y han exigido un esfuerzo en los ámbitos de investigación, industria y Estado hacia la búsqueda de tecnologías no térmicas y sistemas inhibitorios naturales que permitan el consumo de alimentos seguros mínimamente procesados.
Atendiendo a la demanda de los consumidores, en estos últimos años, la investigación científica (no de artículos científicos por año) se ha ampliado además de a los alimentos clásicos (lácteos y cárnicos) hacia alimentos RTE (100 publicaciones por año), ahumados (50), jamón curado (25), productos loncheados (40), hortalizas cortadas, huevos, zumos, etc. El jamón curado como vehículo de listeria es uno de los alimentos muy estudiados en España debido a la exigencia de “tolerancia 0” de L. monocytogenes para realizar la exportación de este producto a U. S.
En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de trabajos de tecnologías no térmicas aplicadas a listeria. Entre todas ellas, destacan el uso de altas presiones hidrostáticas e irradiación, cuyo uso cada vez está más extendido en la industria. Otros procesos tecnológicos son los pulsos de alto voltaje, ultrasonidos, microondas, microfiltración etc.
En cuanto a los sistemas inhibitorios naturales son muchos y variados. La fermentación es un sistema muy eficaz de conservación que proviene del neolítico, aunque entonces se usara de forma empírica. Queso, leche fermentada, embutidos o vegetales son alimentos que forman parte de nuestra cultura y que gracias a la fermentación producida principalmente por bacterias lácticas. Tradicionalmente, las bacterias eran las que contenían el alimento o las que estaban en el medio ambiente en que se procesaban, y hoy en día son fundamentalmente adicionadas a través de cultivos iniciadores comerciales. Estas bacterias actúan de “barreras” para el desarrollo de microorganismos alterantes y de los potencialmente patógenos, entre ellos de L. monocytogenes. Los principales mecanismos de antagonismo microbiano de las bacterias lácticas son la competencia por los nutrientes, la formación de ácido láctico y acético y la producción de otras sustancias como el etanol, dióxido de carbono, diacetilo, acetaldehído, peróxido de hidrógeno, ácido benzoico, isómeros D de aminoácidos, reuterina y bacteriocinas. (Figura 3).
Otros antimicrobianos provienen de la misma matriz alimentaria. En la leche existen sistemas naturales con efecto anti-listeria tales como la activación del sistema lactoperoxidasa de la leche y la lactoferrina. En carnes también pueden encontrarse péptidos antimicrobianos endógenos. Otros sistemas naturales son los aceites esenciales de plantas y la lisozima (presente en plantas, las lágrimas y el huevo) aunque esta última no ha demostrado ser efectiva de forma individual frente a listeria.
La “teoría de las barreras” consiste en colocar distintos obstáculos en el alimento que limiten o impidan el crecimiento del patógeno, de manera que puedan darse entre ellos combinaciones aditivas o sinérgicas y se logre la estabilidad y seguridad del alimento con un menor procesamiento y de forma más económica. En base a esta teoría se han desarrollado múltiples combinaciones de antimicrobianos y tratamientos que han demostrado ser efectivas frente a L. monocytogenes. En la base de datos Web of Science (WOS del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades) se obtienen 1435 entradas de artículos científicos referidos a las palabras clave Listeria y tratamiento combinado, alrededor de 100 publicadas por año en estos últimos 5 años. Algunos de ellos combinan tratamientos no térmicos entre sí. Se estudió el efecto sobre listeria de altas presiones combinadas con campos pulsados (PEF) y sonicación. En leche y productos lácteos, se describió efectos sinérgicos potentes por la combinación de reuterina (3-hidroxipropionaldehido antimicrobiano producido a partir de glicerol por algunas cepas de Lactobacillus reuteri) con bacteriocinas (péptidos antimicrobianos producidos por bacterias) como nisina, lacticina 481 o enterocina AS-48 y por la activación del sistema lactoperoxidasa de la leche con las bacteriocinas nisina y enterocina AS-48. En queso, también describieron un efecto sinérgico por la combinación de altas presiones con las bacteriocinas lacticina 481, nisina A, bacteriocina TAB 57 y enterocina AS-48. Gurtler y colaboradores (2019) recogen la eficacia del uso de aceites esenciales en combinación con tratamientos térmicos suaves en verduras, zumos y huevo. Una estrategia también muy interesante para el control de L. monocytogenes en alimentos es el empleo de fagos, que en combinación con altas presiones y con pediocina permitió la inactivación de L. monocytogenes en leche.
Control en alimentos y ambiente alimentario
La normativa europea establece los límites máximos de L. monocytogenes permitidos en cada tipo de alimentos. Exige en alimentos donde no se desarrolla L. monocytogenes a lo largo de la vida comercial un máximo de 100 ufc/g, requiriéndose en alguno casos la ausencia de en 25 g de alimento en alimentos donde podría desarrollarse. En España, la Agencia Española de Seguridad Alimentaria y Nutrición (AESAN) es la responsable de garantizar la seguridad de los alimentos. Es una tarea en la que se coordinan además el Ministerio de Sanidad, Consumo y Bienestar Social y el resto de administraciones, especialmente las autonómicas que son las que tienen la competencia de realizar los controles a los establecimientos alimentarios en forma de inspecciones, auditorías y toma de muestras. Los establecimientos donde se elaboran deben realizar toma de muestras en puntos críticos del proceso, en equipo, zonas, y realizar estudios de vida útil del producto para establecer la fecha de caducidad.
En conclusión, L. monocytogenes es un patógeno alimentario invasivo causante de la listeriosis. Con un riesgo bajo pero alta peligrosidad por su alta tasa de muerte. En estos últimos 15 años, se ha incrementado la investigación sobre L. monocytogenes y su presencia en alimentos clásicos, en el ambiente alimentario y en nuevos alimentos como RTE y vegetales crudos. Además, se han ensayado tratamientos anti-listeria clásicos como el térmico y otros no térmicos como altas presiones e irradiación y sistemas inhibitorios naturales. La combinación de distintos tratamientos proporciona en ocasiones sinergias que podrían mejorar la seguridad del alimento con tratamientos más suaves. Algunos de estos tratamientos, como las altas presiones e irradición, ya se están empleando con éxito en la industria alimentaria para obtener alimentos más seguros y de calidad. La coordinación de Administración, Investigación y sector industrial permitirá un avance cada vez mayor en conseguir mejorar la seguridad antilisteria.
